Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒介紹
Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒注意事項(xiàng)
1.長(zhǎng)期不用可以-20℃保存。
2.Annexin V-APC染色液避免反復(fù)凍融。多次凍融會(huì)導(dǎo)致失效。
3.Annexin V-APC染色液需要長(zhǎng)期保存時(shí)可以根據(jù)使用情況進(jìn)行小量分裝后-20℃保存。
4.試劑拆封后請(qǐng)盡快使用完！
檢測(cè)方法
1.流式細(xì)胞儀
2.激光共聚焦
3.熒光顯微鏡
適用樣本
1.懸浮細(xì)胞
2.貼壁細(xì)胞
產(chǎn)品特點(diǎn)
1.方便：可用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)；
2.快速：1小時(shí)內(nèi)即可完成實(shí)驗(yàn)；
3.準(zhǔn)確：能準(zhǔn)確區(qū)分活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，并計(jì)數(shù)各群細(xì)胞的比例。
產(chǎn)品應(yīng)用
1.流式細(xì)胞儀
2.激光共聚焦
3.熒光顯微鏡
儀器準(zhǔn)備
1.流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡或激光共聚焦
2.離心機(jī)
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
試劑準(zhǔn)備
1.PBS 緩沖液（pH7.4，實(shí)驗(yàn)室常用的10mM磷酸緩沖鹽溶液（1X））
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）
耗材準(zhǔn)備
1.離心管
2.吸頭
3.一次性手套
4.鋁箔
Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒使用注意事項(xiàng)
1.螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開蓋時(shí)液體損失導(dǎo)致試劑量不夠用。
2.細(xì)胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞。離心力在不損失細(xì)胞的前提下盡可能小，重懸細(xì)胞是動(dòng)作要輕柔，避免多次反復(fù)的激烈吹打。不用渦旋振蕩器。
3.Annexin V-FITC（等）和Propidium iodide（等）是光敏物質(zhì)，在操作時(shí)請(qǐng)注意避光，盡量減少它們暴露在光下的時(shí)間。有必要時(shí)可以使用帶蓋子的冰盒或鋁箔紙避光。標(biāo)記后將細(xì)胞保持在避光環(huán)境中。移液過程中短暫暴露在光線下（<30秒）是可以接受的。
4.由于細(xì)胞凋亡是一個(gè)快速和動(dòng)態(tài)的過程，因此在染色后立即進(jìn)行分析。
5.使用Annexin V-FITC（等） 試劑盒檢測(cè)凋亡需要針對(duì)活細(xì)胞。不要固定細(xì)胞，固定操作會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾。
使用方法
樣品染色：
1. 離心收集懸浮細(xì)胞。離心機(jī)300×g -500×g力，2-8°C，離心時(shí)間5分鐘，棄培養(yǎng)基。
2. 用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次。（300×g -400×g，2-8°C，離心時(shí)間5分鐘收集細(xì)胞）。
3. 用100 μl 1X Annexin V結(jié)合液懸浮細(xì)胞，濃度大約為1-5 X 106 cells/ml。
4. 在細(xì)胞懸浮液中加入5 μl Annexin V-APC染色液，輕輕混勻后于2-8°C避光條件下孵育5-15分鐘。
5. 加入PI（或7-AAD）染色液后輕輕混勻于2-8°C避光條件下孵育1-3分鐘。（此步驟選做，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要也可以只做APC單染）。
6. 加入400 μl PBS或1X Annexin V結(jié)合液，輕輕混勻。
7. 立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
流式細(xì)胞儀分析：
經(jīng)處理過的細(xì)胞此時(shí)可以在流式細(xì)胞儀上分析。
按照常規(guī)的流式凋亡檢測(cè)的操作即可。
Annexin V-APC的熒光激發(fā)波長(zhǎng)652 m，發(fā)射波長(zhǎng)670 m；PI熒光激發(fā)波長(zhǎng)535 m，發(fā)射波長(zhǎng)在620 m。
上機(jī)檢測(cè)前，須用待測(cè)細(xì)胞制備質(zhì)控樣本來設(shè)定流式細(xì)胞儀的熒光補(bǔ)償和設(shè)置十字門的范圍：
（I） 未轉(zhuǎn)染GFP等標(biāo)記的細(xì)胞
① 空白管：陰性對(duì)照組細(xì)胞，沒有染色的細(xì)胞。不加Annexin V/APC，PI。用于調(diào)節(jié)電壓。
② 單染管：有明顯凋亡的細(xì)胞，只加Annexin V/APC染色。用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。
③ 單染管：有明顯凋亡的細(xì)胞，只加PI染色。用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償
④ 檢測(cè)管：待測(cè)的處理細(xì)胞，加Annexin V/APC，PI。用空白管和單陽管調(diào)節(jié)好電壓補(bǔ)償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。
（II） 轉(zhuǎn)染GFP細(xì)胞
① 未轉(zhuǎn)染空白管：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，陰性對(duì)照組細(xì)胞，沒有染色的細(xì)胞。不加Annexin V/APC，PI。用于調(diào)節(jié)電壓。
② 轉(zhuǎn)染GFP空白管：轉(zhuǎn)染GFP的對(duì)照組細(xì)胞，沒有染色的細(xì)胞。不加Annexin V/APC，PI。用于調(diào)補(bǔ)償
③ 未轉(zhuǎn)染單染管：未轉(zhuǎn)染且有明顯凋亡的細(xì)胞，只加Annexin V/APC染色。用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。
④ 未轉(zhuǎn)染單染管：未轉(zhuǎn)染且有明顯凋亡的細(xì)胞，只加PI染色。用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償
⑤ 檢測(cè)管：待測(cè)的處理細(xì)胞，加Annexin V/APC，PI。用空白管和單陽管調(diào)節(jié)好電壓補(bǔ)償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。
常見問題分析
實(shí)驗(yàn)過程中Annexin V染不上色或陽性率偏低。可能的原因如下：
1. 用于檢測(cè)的流式細(xì)胞儀/顯微鏡設(shè)置不當(dāng)。調(diào)整使用正確的儀器設(shè)置。
2. 確定實(shí)驗(yàn)中的誘導(dǎo)劑是否能產(chǎn)生凋亡。可通過設(shè)定確切凋亡誘導(dǎo)效果的陽性藥物對(duì)照來排除這一情況。
3. 細(xì)胞未啟動(dòng)凋亡。重新確定誘導(dǎo)后凋亡啟動(dòng)的時(shí)間點(diǎn)（時(shí)程實(shí)驗(yàn)）。
4. 細(xì)胞數(shù)量偏少。增加細(xì)胞數(shù)量。
5. 貼壁細(xì)胞消化不當(dāng)。Annexin V 跟PS 的結(jié)合需要Ca2+離子，結(jié)合液中含有Ca2+，EDTA 的消化會(huì)影響染色，建議使用無EDTA 的，或者消化后用PBS洗滌干凈。
實(shí)驗(yàn)過程中陽性率偏高。可能的原因如下：
1. 用于檢測(cè)的流式細(xì)胞儀/顯微鏡設(shè)置不當(dāng)。調(diào)整使用正確的儀器設(shè)置。
2. 細(xì)胞本身活力太差。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)未經(jīng)誘導(dǎo)凋亡的對(duì)照細(xì)胞經(jīng)染色后AnnexinV+/PI+雙陽性的細(xì)胞比例過高，造成這種結(jié)果的原因可能是細(xì)胞本身活力太差。建議用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞的活力，臺(tái)盼藍(lán)拒染的細(xì)胞應(yīng)大于95%。若活力偏低低，建議重新復(fù)蘇細(xì)胞，通常剛復(fù)蘇的細(xì)胞至少要傳代3 次以后才能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
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產(chǎn)品型號(hào)：
